Avocat issu du premier mariage de son père, il eut un frère jumeau, Jean, devenu médecin, dont il resta très proche toute sa vie et qui ne le quitta jamais. Les deux frères furent, jusqu’à leur mort, de fervents adeptes de la religion réformée qu’ils découvrirent, raconte Nicolas, dans un manuscrit chiffré dérobé à un enseignant flamand. Jusqu’en 1560, ils vécurent leur foi de manière confidentielle, refusant la rupture avec les voisins, amis, parents, restés catholiques.

En 1560, suite à une grave maladie, Nicolas décida de se retirer à Genève, pour pouvoir vivre sa foi en conformité avec ses croyances. Cette décision, lourde de conséquences, impliqua l’abandon des charges et responsabilités publiques, et la rupture des liens sociaux auparavant tissés. Il dut aussi confier à des personnes de confiance la gestion de son patrimoine troyen.

À Genève, auprès de Calvin, mais aussi à Paris, auprès de la cour, il se fit le protecteur et le porte-parole de la communauté réformée de Troyes. Mais le déclenchement de la guerre civile et religieuse le contraignit à un exil prolongé (entrecoupé de quelques séjours troyens), d’où il assista au naufrage de cette communauté, anéantie par les abjurations, les fuites, les exils, les massacres, en dépit de quelques périodes de « temporisations ». Il garda toujours, nous dit-il, « les yeux tournés vers la ville de Troyes, et avait au nez le flair et l’odeur des andouilles de Troyes ».

La Chronique qu’il rédigea alors peut paraître comme un véritable substitut à cette « bonne ville » natale. Elle reste son ouvrage le plus important. Prête pour l’impression,  elle  dut  cependant  attendre  quatre  siècles  avant  d’être  éditée. En dépit de moyens financiers limités, il poursuivit, avec son frère jumeau, la politique d’achat de livres entamée par son père, afin d’augmenter la collection familiale.

Le plus célèbre des Pithou. Son père encouragea vivement en lui son goût pour la littérature, et il maîtrisa très jeune le latin, le grec et l’hébreu. Il fit ses études au collège de Troyes, puis à Paris, enfin à Bourges où il suivit les leçons de droit civil dispensées par le célèbre juriste Cujas. En 1560, il intégra le barreau de Paris comme avocat, mais se consacra essentiellement à des consultations, tout en poursuivant ses études. Comme ses frères et sœurs, il fut élevé dans les croyances calvinistes. Les troubles religieux qui ensanglantèrent la France à partir des années 1560 le poussèrent à multiplier les séjours à l’étranger (Suisse, Angleterre).

Mais en 1572, il se trouvait à Paris le jour de la Saint- Barthélémy et échappa de peu au massacre. Il décida de réintégrer le giron de l’Eglise catholique l’année suivante. Profondément humaniste, épris de paix et de justice, il fut un royaliste convaincu. Lorsque la Ligue ultra-catholique s’opposa au roi Henri III, puis à son successeur Henri IV, il soutint ceux-ci sans états d’âme et multiplia les écrits en leur faveur. Il fut ainsi l’un des principaux collaborateurs de la Satire Ménippée (1593), libelle satirique qui connut un grand succès et contribua à discréditer la Ligue, ramenant les esprits à des sentiments plus raisonnables et royalistes. Henri IV, conscient de sa valeur, lui confia des postes de confiance.

Son œuvre de juriste, d’historien, mais aussi de théologien, de canoniste, de philologue, est une des plus importantes de son temps. Même au milieu des troubles, il ne cessait de se consacrer à des recherches historiques et archéologiques, écrivant des ouvrages savants, faisant imprimer des manuscrits oubliés, collectionnant des livres anciens.

Juriste de renom, il entretint des liens très étroits avec son frère Pierre, avec qui il collabora dans la rédaction d’ouvrages et dans l’enrichissement de la bibliothèque familiale. Après la mort de ses frères, il vécut jusqu’à son propre décès dans la maison familiale troyenne. Il la légua par testament, ainsi que de nombreux biens et une partie de la bibliothèque, à la ville pour en faire le collège de Troyes, le « Collegium Pithoe-Tricassinum ».