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Le XVIe siècle vit éclater l’unité de l’Église occidentale, en raison de la volonté d’un moine allemand, Martin Luther, suivi en cela par de nombreux autres réformateurs (dont le Français Calvin, installé à Genève) de corriger ce qu’il considérait être les abus de l’Église de Rome (celle du pape). L’Europe se divisa alors entre catholiques, qui restèrent fidèles au pape, et protestants (ou réformés).
La famille Pithou participa pleinement à ces interrogations religieuses du XVIe siècle. Tous ses membres, du père, Pierre « Ier », aux fils, filles, neveux, nièces, furent de façon plus ou moins constante des adeptes de la Réforme. Cela ne les empêchait pas de conserver des liens étroits avec l’Église catholique qui restait une institution incontournable dans la vie de tout habitant du royaume de France. L’éclatement des guerres de religion, au début des années 1560, obligea chacun à se positionner. Les frères aînés, Nicolas et Jean, décidèrent de rester en-dehors de l’Église de Rome, ce qui leur imposa une existence des plus précaires et mouvementées. Les cadets, Pierre et François, réintégrèrent définitivement le giron de l’Église catholique après le massacre de la Saint-Barthélémy en 1572.
Deux œuvres, l’une rédigée par Nicolas Pithou, l’autre co-écrite par son demi-frère Pierre avec d’autres grands intellectuels de l’époque, portent témoignage des passions et interrogations religieuses et politiques qui secouèrent l’Occident au XVIe siècle : La Chronique de Troyes et de la Champagne (pour la présentation de cette œuvre, voir la rubrique Les Pithou, la passion des livres et du savoir) et La Satyre Ménippée.